Tecnologia del DNA ricombinante: enzimi di restrizione, DNA ligasi, vettori plasmidici, colture cellulari e trasformazione batterica

Tagliare e incollare il DNA

La tecnologia del DNA ricombinante unisce frammenti genetici di organismi diversi. Gli enzimi di restrizione agiscono come forbici molecolari: riconoscono siti specifici e tagliano la doppia elica, spesso producendo sticky ends, estremità coesive utili per l’appaiamento. La DNA ligasi è la colla molecolare: forma legami fosfodiesterici tra i frammenti consumando $ATP$. La reazione documentata è:

Vettori plasmidici

I vettori plasmidici sono piccoli DNA circolari extracromosomici. Un buon vettore deve avere:

• origine di replicazione ($ori$), per duplicarsi autonomamente;
• sito di clonaggio multiplo ($MCS$), dove inserire il gene;
• gene marcatore, per esempio $Amp^R$, che conferisce resistenza all’ampicillina.

Trasformazione e selezione

Nella trasformazione batterica i batteri sono resi competenti con ioni $Ca^{2+}$ a basse temperature e sottoposti a shock termico, per esempio da $0\ ^\circ C$ a $42\ ^\circ C$. Il plasmide entra attraverso i pori della membrana. Infine, la piastratura su antibiotico seleziona i batteri trasformati: solo chi possiede il plasmide cresce e forma colonie.